提升螢光顯微影像精準度-你了解像素偏移嗎？

什麼是像素偏移？

當細胞內結構以多種螢光染劑標記並依序拍攝時，理論上這些影像應該完全重疊。但實際上，由於光學濾片或儀器微小誤差，導致不同顏色影像在感光元件上的位置出現偏差。

例如使用三種不同濾片（每一個對應一種螢光染劑）來成像一個經多重標記的螢光點，「像素偏移」現象（左圖）會導致在合成影像中，各種顏色的螢光點出現位置不一致的錯位情形；而若使用「零像素偏移」的濾片組，則所有螢光點在合成影像中能夠完美對齊（右圖）*。*此情境假設成像光路中所有其他光學元件（如鏡頭）均不產生色差。

為什麼像素偏移值得重視？

在蛋白質共定位分析*（colocalization）等實驗中，即便只有單一像素的誤差，也可能導致錯誤的生物學詮釋。像素偏移不僅影響資料可信度，更可能誤導疾病研究與藥物開發方向。*蛋白質共定位:蛋白質彼此共同出現在細胞中的相同區域

•  像素偏移會影響蛋白質共定位分析（Colocalization analysis），進而導致錯誤推論，例如誤以為蛋白質未共存。
•  在疾病機制研究、藥物開發與細胞功能分析上，像素偏移會降低資料可信度。
•  範例：使用「零像素偏移」濾片可正確觀察蛋白質與微管位置關係，而未校正濾片可能誤導判讀。

 
左側(a)的影像是使用沒有進行像素偏移校正的濾光片組採集的，而當使用具有「零像素偏移」性能的濾光片組對同一樣本進行成像(b)時，核配蛋白確實出現在微管的尖端。Images courtesy of Mohan Gupta and David Pellman at Dana-Farber Cancer Institute and Harvard Medical School in Boston.

像素偏移的成因

•    濾片非平行（楔角）。
•    濾片轉盤震動或機械不穩定。
•    鏡體誤差（如基座不平或濾片架設不良）。

其中以二向色鏡與發射濾光片的楔角誤差最為關鍵。

如何校正像素偏移

硬體方式：
•  使用零像素偏移濾片組（如 Semrock BrightLine ZERO™），可在設計製造階段將楔角誤差降至最低。
•  新一代硬鍍膜濾片（如 IBS 技術）可大幅改善過去軟鍍膜製程的限制。

軟體方式：
•  使用校正演算法對影像進行後處理（需先拍攝多色參考標記，如TetraSpeck™ beads）。
•  缺點是需手動操作與時間成本高、精度有限，且不易自動化。