增強「螢光顯微系統訊號」的好幫手 - 超高效能濾片組
增強「螢光顯微系統訊號」的好幫手 - 超高效能濾片組
使用 Semrock Avant 濾光片系列，提升螢光最大效能
Semrock ® Avant™ 濾光片組系列的每一片，都對應的短斯托克斯位移螢光團，提供了明顯的螢光效能提升。我們介紹這項發展背後的基本原理以及它是如何實現的。
基本原理
生物顯微鏡中使用的螢光濾光片組由以下部分組成：
• 激發光濾片，限制激發光波長範圍
• 二向色分光鏡，將激發光射向樣品並將較長波長的被激發光反射向偵測器
• 被激發光濾片，將被激發的螢光，限制波長範圍傳遞到偵測器
激發光大於螢光團的波長，被激發光大於激發光波長。這裡的問題是波長的最佳選擇位置以及斯托克斯位移的大小。
斯托克斯位移是激發和被激發光波長峰值之間的距離。具有大斯托克斯位移的螢光團具有廣泛距離的激發和被激發峰值，並且濾光片範圍以峰值的激發和被激發波長為中心，提升最大螢光效能。然而，普遍短斯托克斯位移螢光團的濾光片位置靠近邊緣，因此通常需要在訊號和波長之間進行折衷，如下所示。
短斯托克斯位移螢光團的濾光片範圍通常排列如圖 1 所示。最接近交叉波長的激發和被激發光譜邊緣被稱為「臨界邊緣」。臨界邊緣的間隙通常相對於螢光團的交叉波長非常不對稱。這種不對稱將被激發光範圍推向更長的波長，導致被激發光濾片收到的光範圍減少，從而降低濾光片組的性能。
圖 1：具有相應激發和被激發光濾片（黑色實線）的螢光團的激發（紅色虛線）和被激發（紅色實線）光譜示意圖。
差距之所以難以縮小，有兩個原因。第一，與短斯托克斯位移螢光團的窄間隙導致光位移，即激發光從樣本平面反射到被激發濾光片中。第二，兩個關鍵邊緣波長位置不能太靠近，因為螢光變化導致的位置變化可能會導致濾光效果減少。儘管 Semrock 濾光片在生產批次內和批次之間提供了絕佳的一致性，但臨界邊緣的周圍位置需要在精度進行前所未有的改進。
由於所描述的性能缺陷適用於現行的短斯托克斯位移螢光團，因此整個行業中相應濾光片組的系統性性能不佳。由於IDEX Health & Science 最近在改進Semrock 光學濾光片塗層性能和計量能力方面取得了更高一階技術，我們著手改進短斯托克斯位移螢光團（即相對於交叉點位移小於3% 的螢光團）的濾光片組的性能波長。這些改進現已在 Avant 濾鏡套件系列中提供。
範例
使用三個步驟來避免上述限制：
1. 與標準濾光片組中的版本相比，臨界邊緣明顯變陡。
2. 一旦邊緣變陡，臨界邊緣位置就會靠得更近。
3. 激發和被激發光中均實施了深度互補阻擋（OD 10，設計規範），以抑制激發光漏光。
Semrock 最近的關鍵專有進展使這成為可能：
• 優化濾光片塗層製程的控制，可以實現更陡峭的臨界邊緣。
• 精確邊緣位置功能可以提高臨界邊緣的波長精度，從而使邊緣位置的統計分佈更加緊密。
• KolaDeep™ 光譜測量系統能夠測量低至 OD 8 或更高的 OD，並能夠解析比邊緣波長陡峭的0.2%，用於確認臨界邊緣特性。
結果
圖 2 顯示了一個範例，其中顯示了 Cy5.5 螢光團的被激發螢光訊號的模擬增加。
圖 2：與 Brightline（藍線）濾光片組相比，Cy5.5 的 Avant 濾光片組（紅線）增強了訊號。
使用 SearchLight 模擬工具 使用新濾光片組的測量光譜進行建模，如表 1 所示。螢光明顯改善，如最右列所示，（如最右列所示 ）
| Fluorescent Probe | Excitation Source | Filter Set | Fluorescence Signal × 106 | Excitation Light Bleedthrough × 109 | Fluorescence Signal Improvement with Avant |
| Venus | 510 nm LED (X-Cite NOVEM) | LED-Venus-A | 3.53 | 1.15 | 29% |
| Avant Venus-YFP | 4.54 | < 10-4 | |||
| Cy3 | 555 nm LED (X-Cite NOVEM) | Cy3-4040C | 2.79 | 0.65 | > 50% |
| Avant Cy3 | 4.63 | < 10-4 | |||
| Cy5.5 | 655 nm Lumiled LXM3-PD01 | Cy5.5-C | 1.76 | 1.2 | 31% |
| Avant Cy5.5 | 2.3 | < 10-4 | |||
| Cy7 | 740 nm CoolLED | LED-Cy7-A | 4.28 | 5.2 | 26% |
| Avant Cy7 | 5.38 | < 10-4 |
使用 Cy5.5 的 Semrock 光學濾光片客戶的早期結果表明，與現有濾光片組相比，使用 Cy5.5 Avant 濾光片組時螢光訊號比背景增加了 40% 以上。
總結
Avant 濾光片組系列可為優先考慮單波段濾光片組效率、速度和性能，應用領域提供極佳的螢光訊號和訊號雜訊比。此外，這項新的 Avant 技術現在可用於客製化。我們歡迎所有基於螢光的工具的 OEM 開發商的詢問。
文章來源: https://www.idex-hs.com/news-events/stories-and-features/detail/maximize-fluorescence-performance